PMAD

pMAD: click to enlarge

General comments

A plasmid for generating gene inactivation mutants in naturally nontransformable gram-positive bacteria. This vector allows, on X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) plates, a quick colorimetric blue-white discrimination of bacteria which have lost the plasmid, facilitating clone identification during mutagenesis. The plasmid is can be used in Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, and Bacillus spp. to efficiently construct mutants with or without an associated antibiotic resistance gene.

• E.coli: multicopy plasmid, select for ampicillin
• B. subtilis: temperature-sensitive ori, select for erythromycin/ lincomycin

Hints for the usage

• for a markerless deletion of a gene amplify 1000 bp up- and downstream of the gene and clone them into the MCS of the plasmid

The reference

Sequencing oligos

• JG138 pMAD seq fwd: GCAACGCGGGCATCCCGATG
• JG139 pMAD seq fwd: CCCAATATAATCATTTATCAACTCTTTTACACTTAAATTTCC

The sequence

• GAATTAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATTCACAAAAAATAGGC

ACACGAAAAACAAGTTAAGGGATGCAGTTTATGCATCCCTTAACTTACTT ATTAAATAATTTATAGCTATTGAAAAGAGATAAGAATTGTTCAAAGCTAA TATTGTTTAAATCGTCAATTCCTGCATGTTTTAAGGAATTGTTAAATTGA TTTTTTGTAAATATTTTCTTGTATTCTTTGTTAACCCATTTCATAACGAA ATAATTATACTTTTGTTTATCTTTGTGTGATATTCTTGATTTTTTTCTAC TTAATCTGATAAGTGAGCTATTCACTTTAGGTTTAGGATGAAAATATTCT CTTGGAACCATACTTAATATAGAAATATCAACTTCTGCCATTAAAAGTAA TGCCAATGAGCGTTTTGTATTTAATAATCTTTTAGCAAACCCGTATTCCA CGATTAAATAAATCTCATTAGCTATACTATCAAAAACAATTTTGCGTATT ATATCCGTACTTATGTTATAAGGTATATTACCATATATTTTATAGGATTG GTTTTTAGGAAATTTAAACTGCAATATATCCTTGTTTAAAACTTGGAAAT TATCGTGATCAACAAGTTTATTTTCTGTAGTTTTGCATAATTTATGGTCT ATTTCAATGGCAGTTACGAAATTACACCTCTTTACTAATTCAAGGGTAAA ATGGCCTTTTCCTGAGCCGATTTCAAAGATATTATCATGTTCATTTAATC TTATATTTGTCATTATTTTATCTATATTATGTTTTGAAGTAATAAAGTTT TGACTGTGTTTTATATTTTTCTCGTTCATTATAACCCTCTTTAATTTGGT TATATGAATTTTGCTTATTAACGATTCATTATAACCACTTATTTTTTGTT TGGTTGATAATGAACTGTGCTGATTACAAAAATACTAAAAATGCCCATAT TTTTTCCTCCTTATAAAATTAGTATAATTATAGCACGAGCTCTGATAAAT 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AAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAA GAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAG GCCCTTTCGTCTTCAA